薬効薬理

作用機序^31〜36）

本剤の作用機序は明確ではないものの、A5-HT_1D、5-HT_2A、5-HT_2C受容体など脳内の特異的セロトニン受容体に対する刺激作用、並びにBシグマ-1受容体に対する正のモジュレーター作用を介すると考えられる。

非臨床試験

1. In vitro試験

1. ①受容体またはチャネルに対する結合活性

   • 1-1：フェンフルラミン及びノルフェンフルラミン^37）

     37）日本新薬株式会社 社内資料（承認時評価資料）：受容体結合特性試験

     フェンフルラミン及びノルフェンフルラミン（1×10^-6及び1×10^-5mol/L）の受容体及びイオンチャネル（47種類）に対する結合能について、放射性リガンド結合試験で評価した。
     結合阻害率^※≧30％を示した受容体及びイオンチャネルは、βアドレナリン受容体（非選択的）、β₂アドレナリン受容体、ムスカリンM₁受容体、ナトリウムイオンチャネル（非選択的）、セロトニン5-HT_1A受容体及びシグマ受容体（非選択的）であった。

     ※結合阻害率＝［1-｛（被験物質存在下の結合放射能）/（総結合放射能）｝］×100

   • 1-2：フェンフルラミン及びノルフェンフルラミンの各光学異性体^38）

     38）日本新薬株式会社 社内資料（承認時評価資料）：受容体結合活性

     フェンフルラミン及びノルフェンフルラミンの各光学異性体（1×10^-6及び1×10^-5mol/L）の受容体及びイオンチャネル（12種類）に対する結合能について、放射性リガンド結合試験で評価した。
     フェンフルラミン及びノルフェンフルラミンの光学異性体間で、結合能に違いは認められなかった。
     フェンフルラミンの光学異性体は、ノルフェンフルラミンの光学異性体と比べて、セロトニン5-HT_1A 、シグマ-1及びシグマ-2受容体に対して強く結合することが示された。一方、ノルフェンフルラミンの光学異性体は、フェンフルラミンの光学異性体と比べてセロトニン5-HT_2B受容体及び5-HT_2C受容体に対して強く結合することが示された。

②受容体機能活性^39）

③シグマ-1受容体に対するフェンフルラミンの作用^{39, 40）}

PRE-084誘発性のBiP-シグマ-1受容体複合体の解離に対するフェンフルラミンの作用

④ナトリウムチャネル電流に対する作用^41）

⑤プロラクチン及びコルチコステロン分泌に対する作用^42）

2. In vivo試験

1. ①ゼブラフィッシュモデルに対する作用

   • 1-1：てんかんの発作頻度及び持続時間に対するセロトニンアゴニスト作用^33）

     33）Sourbron J, et al., ACS Chem Neurosci. 2016; 7: 588-98

     フェンフルラミン及び5-HT_1D、5-HT_2A、5-HT_2C受容体アゴニストは、Dravet症候群のゼブラフィッシュモデル^＊におけるてんかんの発作頻度及び持続時間を減少させた（フェンフルラミン、5-HT_1D：p＜0.001、5-HT_2A、5-HT_2C：p＜0.0001、Mann-Whitney検定）。

     方法：受精後6日のscn1Lab^-/-遺伝子変異を有するゼブラフィッシュ幼生（各群n≧8）を溶媒又は各化合物（5-HT_1D、5-HT_1E、5-HT_2A、5-HT_2B、5-HT_2C、5-HT₇受容体アゴニスト及びフェンフルラミン）で22hrインキュベートし、受精後7日に2％低融点アガロース（麻酔薬不使用）で固定した。ガラス電極を前脳に挿入し、てんかんの発作頻度及び持続時間を記録した。

     • ＊SCN1A遺伝子を改変することにより、その機能を欠失させて作製されたゼブラフィッシュ（scn1Lab^-/-遺伝子変異）。Dravet症候群患者の約80％はSCN1A遺伝子にこの変異を有している。
   • 1-2：フェンフルラミンのてんかんの発作頻度及び持続時間抑制作用に対するセロトニンアンタゴニストの作用^34）

     34）Sourbron J, et al., Front Pharmacol. 2017; 8: 191

     フェンフルラミン単独処置により認められたDravet症候群ゼブラフィッシュモデルにおけるてんかんの発作頻度及び持続時間抑制作用は、5-HT_1D及び5-HT_2C受容体アンタゴニストとの併用により阻害された。5-HT_2A受容体アンタゴニストとの併用では、フェンフルラミンの作用は阻害されなかった（5-HT_1D、5-HT_2C：p＜0.05、Mann-Whitney検定）。

     方法：受精後6日のscn1Lab^-/-遺伝子変異を有するゼブラフィッシュ幼生（各群n≧13）を溶媒又は各化合物（フェンフルラミン、5-HT_1D、5-HT_2A、5-HT_2B、5-HT_2C受容体アンタゴニスト）で22hrインキュベートし、受精後7日に2％低融点アガロース（麻酔薬不使用）で固定した。ガラス電極を前脳に挿入し、てんかんの発作頻度及び持続時間を記録した。

   • 1-3：自発運動の亢進及びてんかん様事象の頻度に対するシグマ-1受容体の正のモジュレーター作用^36）

     36）Martin P, et al., Int J Mol Sci. 2021; 22: 8416

     フェンフルラミンと、シグマ-1受容体の正のモジュレーター作用を持つSOMCL-668は、Dravet症候群のゼブラフィッシュモデルにおける自発運動の亢進及びてんかん様事象の頻度を有意に抑制した（フェンフルラミン：p＜0.001及びp＜0.001、SOMCL-668：p＜0.001及びp＜0.01、自発運動の亢進：ANOVA及びDunnet多重比較検定、てんかん様事象の頻度：Mann-Whitney検定）。

     方法：scn1Lab^-/-遺伝子変異を有するゼブラフィッシュ幼生又は野生型（各群n=9～20）を溶媒又は各化合物（SOMCL-668及びフェンフルラミン）を用いて処理し、自発運動の亢進とてんかん様事象の頻度を記録した。

2. ②マウス発作モデルに対する作用

   • 2-1：ペンテトラゾール（PTZ）誘発性発作に対する影響^43）

     43）Wong JC, et al., FASEB J. 2017; 31(suppl 1）: 813.7

     2種類のSCN1A変異マウスモデルにおいて、フェンフルラミン（17mg/kg）により初回のPTZ誘発性全般強直間代発作までの潜時が延長した。DOI（3、5.6mg/kg、5-HT_2A受容体アゴニスト）ではPTZ誘発性発作に対する抵抗性が増加した。

     方法：2種類のSCN1A変異マウスモデル（Dravet症候群モデル：Scn1a^+/-ノックアウトマウス、全般てんかん熱性けいれんプラスモデル：R1648H変異型Scn1a^RH/+ノックインマウス）を用い、PTZ誘発性発作に対するフェンフルラミン及びDOIの活性を評価した。

   • 2-2：NMDA（グルタミン酸作動性N-メチル-D-アスパラギン酸）誘発発作に対する影響^44）

     44）Rodríguez-Muñoz M, et al., Oncotarget. 2018; 9: 23373-89

     NMDA誘発発作に対し、フェンフルラミン（d体）及びノルフェンフルラミン（d体）は、初回発作までの潜時を延長し、発作持続時間を短縮した（いずれもp＜0.05、Dunnet多重比較検定）。また、NMDA誘発性の死亡も抑制した。4F 4PP（5-HT_2A受容体アンタゴニスト、3nmol）の脳室内投与により、フェンフルラミン（d体）及びノルフェンフルラミン（d体）のNMDA誘発発作に対する抑制効果は部分的に阻害された。

     方法：CD-1マウスにNMDA（300pmol）^※を脳室内投与することでNMDA誘発発作を惹起した。フェンフルラミン（d体）及びノルフェンフルラミン（d体）はNMDA投与30分前に脳室内投与（各3nmol）し、NMDA誘発発作に対する影響を行動薬理学的観察（強迫性立ち上がり、自発運動の亢進、間代性痙攣、強直性痙攣、死亡など）により評価した（各群n=6～9）。

     • ※ NMDA投与24時間前にモルヒネ（10nmol）によるプライミングを行うことで、NMDA投与量を減量した。
   • 2-3：シグマ-1受容体依存性の学習及び記憶に対する影響^45）

     45）Martin P, et al., Epilepsy Behav. 2020; 105: 106989

     ジゾシルピン（非競合的NMDA受容体アンタゴニスト）誘発性学習障害に対し、PRE-084（0.3mg/kg、シグマ-1受容体アゴニスト）は有意な改善作用を示した（p＜0.01、Dunnet検定）。この改善作用は低用量のフェンフルラミン（0.1、0.3mg/kg）により増強した。フェンフルラミンによる増強作用はNE-100（1mg/kg、シグマ-1受容体アンタゴニスト）により抑制された。

     方法：Swiss OF-1マウスにジゾシルピン（0.15mg/kg）を腹腔内投与することで学習障害^※を誘発させた。PRE-084存在下/非存在下でフェンフルラミンを腹腔内投与し、自発的交替行動試験（空間的行動記憶）及びステップスルー型受動的回避反応試験（非空間的長期記憶）による行動薬理学的観察により、シグマ-1受容体に及ぼすフェンフルラミンの影響を評価した。

     • ※ シグマ-1受容体アゴニストによる改善作用が報告されている。

3. ③ラット発作モデルに対する作用

   • 3-1：最大電撃誘発痙攣に対する影響^46）

     46）Buterbaugh GG, Life Sci. 1978; 23: 2393-404

     フェンフルラミン、pCA、5-ヒドロキシトリプトファン、フルオキセチン、5-メトキシ-N,N-ジメチルトリプタミン、シプロヘプタジン及びメチセルジド（いずれの薬物も投与30分又は1時間後に最大電撃刺激を与えた）は後肢伸展を阻害した。レセルピン、パラクロロアンフェタミン、pCA（4日間投与）及びα-メチル-p-チロシンは後肢伸展を阻害しなかった。pCPAの前投与によりセロトニンを枯渇させると、フェンフルラミン、pCA、フルオキセチン及びシプロヘプタジンの後肢伸展阻害作用は消失した。

     方法：最大電撃刺激により後肢の強直性屈曲伸展反応が認められた伸筋ラット（SDラット）を用いて、フェンフルラミン（1mL/kg、腹腔内投与）及び種々薬物の後肢伸展に及ぼす影響を評価した（各群n=6〜8）。

   • 3-2：ペンテトラゾール（PTZ）誘発性強直発作及び死亡への影響^47,48）

     47）Lazarova M, et al., Life Sci. 1983; 32: 2343-8
     48）Lazarova M, et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1983; 322: 147-52

     A）フェンフルラミン（d体）は初回発作までの潜時に影響が認められなかったが、強直発作を有意に抑制（p＜0.05）し、また死亡率を有意に低下（p＜0.01）させた。クロニジンは0.5mg/kgの用量で、初回発作までの潜時の有意な延長（p＜0.01）、強直発作の抑制（p＜0.05）及び死亡率の低下（p＜0.01）が認められたが、1.0mg/kgの用量では強直発作は抑制されなかった。

     方法：PTZ投与（90mg/kg、皮下）したCD-COBSラットを用いて、PTZ誘発性の発作（初回発作までの潜時、強直発作、全般間代発作）及び死亡（1時間以内の死亡率）に及ぼすフェンフルラミン（d体）及びクロニジン塩酸塩の影響を評価した（初回発作までの潜時はDunnet検定、それ以外はχ²検定）。フェンフルラミン（d体）（5mg/kg）及びクロニジン塩酸塩（0.01〜1.0mg/kg）はPTZの30分前に腹腔内投与した。

     B）フェンフルラミン（d体）又はVPAのいずれも、単独投与では初回発作までの潜時に影響は認められなかったが、併用投与では強直発作の有意な抑制（p＜0.05、χ²検定）及び死亡率の低下が認められた。

     方法：PTZ投与（90mg/kg、皮下）したCD-COBSラットを用いて、PTZ誘発性の発作（初回発作までの潜時、強直発作、全般間代発作）及び死亡（1時間以内の死亡率）に及ぼすフェンフルラミン（d体）及びVPAの影響を評価した。フェンフルラミン（d体）（1.25mg/kg）、VPA（75mg/kg）は、PTZ（90mg/kg、皮下投与）投与30分前に単独又は併用して腹腔内投与した。