薬効薬理

作用機序

ビキセオスは、AMLの標準治療薬であるAraCとDNRを5：1のモル比で含有するリポソーム製剤である。
リポソーム内にAraC及びDNRを封入することにより、最適なモル比を長時間維持したまま白血病細胞へ送達できるよう設計されており、エンドサイトーシス等により白血病細胞内に取り込まれた後、AraC及びDNRを放出することで、腫瘍増殖抑制作用を示すと考えられている。

ビキセオスの構造（イメージ図）

8）承認時評価資料：海外第Ⅱ相試験（CLTR0310-206試験）
12）Kimball AP, et al. Proc Soc Exp Biol Med. 1968; 127（2）: 429-432.
13）Smets LA, et al. Cancer Res. 1985; 45（7）: 3113-3117.
14）Chomienne C, et al. Semin Oncol. 1985; 12（2 Suppl 3）: 60-64.
15）Rusconi A, et al. Biochim Biophys Acta. 1966; 123: 627-630.
16）Marco Di A, et al. J Cell Biol. 1965; 27（3）: 545-550.
17）Calendi E, et al. Biochim Biophys Acta. 1965; 103: 25-49.
18）社内資料：in vitroにおける最適なモル比検討
19）社内資料：マウスモデルにおける非リポソーム型薬剤との薬効比較
20）社内資料：マウスモデルにおける単剤のリポソーム型薬剤との薬効比較

骨髄への移行とAraC及びDNRの放出（イメージ図）

19）社内資料：マウスモデルにおける非リポソーム型薬剤との薬効比較
20）社内資料：マウスモデルにおける単剤のリポソーム型薬剤との薬効比較
21）社内資料：骨髄への蓄積
22）社内資料：白血病細胞への取り込み作用

薬理試験

1. AraCとDNRの最適なモル比の検討

（1）各種細胞株における検討（in vitro）

白血病細胞株7種類と固形がん細胞株8種類に対してAraCとDNRを各モル比（1：10、1：5、1：1、5：1、10：1）で併用し細胞増殖抑制試験を実施した。
15種類の細胞株のうち、75%有効濃度において相乗作用を示した細胞株の割合は、AraCとDNRのモル比が1：10又は1：5で26.7%、1：1で33.3%、5：1で53.3%、10：1で46.7%であり、AraCとDNRのモル比5：1において、相乗的な細胞増殖抑制作用を示した株の割合が最も多かった。

＜試験方法＞

白血病細胞株7種類（CCRF-CEM、HL-60、KBM-3、L1210、MOLT-4、P388、WEHI-3B）と固形がん細胞株8種類（A253、BXPC-3、COLON-26、HCT-116、HT-29、IGROV-1、LS-180、SW620）に対し、AraCとDNRを各モル比（1：10、1：5、1：1、5：1、10：1）で併用し、細胞増殖抑制試験を実施した。合計15種類の細胞株中、75%有効濃度において相乗作用を示した細胞株の割合を算出した。

（2）P388細胞株移植モデルマウスにおける検討（マウス）

P388細胞株を腹腔内に移植した雌性BDF-1マウスを用いて、AraCとDNRを併用する際の最適なモル比を検討した。
NS-87投与群はモル比3：1又は1：1のリポソーム製剤投与群と比較して生存延長作用を示し、10：4mg/kg投与群の生存期間中央値（MST）は63日以上、%ILSは563%以上、移植後63日目の生存数は6例中5例であった。モル比11.6：1のリポソーム製剤の15：3mg/kg投与群のMSTは63日以上、%ILSは563%以上であり、NS-87の10：4mg/kg投与群と同程度の生存延長作用を示した。

NS-87及び種々のモル比のリポソーム製剤を投与したP388細胞株移植モデルマウスの生存率

＜試験方法＞

P388細胞株（マウスリンパ球性白血病細胞株）を腹腔内に移植した雌性BDF-1マウスに対し、生理食塩液（対照）又はNS-87（2：0.8mg/kg、10：4mg/kg）、AraCとDNRのモル比が異なる3種のリポソーム製剤（製剤A［11.6：1］、製剤B［3：1］、製剤C［1：1］）をそれぞれ3用量ずつ、移植後1、4、7日目に静脈内投与した。
移植後63日目まで観察し、生存数、生存期間中央値（MST）、生存期間延長率（%ILS）を算出し比較した。

2. 生存延長作用

（1）NS-87と非リポソーム型AraC・DNR混合物との比較

1）P388細胞株移植モデルマウスにおける生存延長作用（マウス）

P388細胞株移植モデルマウスを用いて、NS-87と非リポソーム型AraC・DNR混合物又は非リポソーム型AraC製剤との薬効を比較した。
NS-87投与群は非リポソーム型AraC・DNR混合物と比較して生存延長作用を示し、12.5：5mg/kg投与群のMSTは67日以上、%ILSは857%以上、移植後67日目の生存数は5例中5例であった。非リポソーム型AraC・DNR混合物投与群は、いずれの投与量においてもNS-87投与群に比べMSTは短く、%ILSは小さかった。また、移植後67日目まで生存した個体はいなかった。

NS-87、非リポソーム型AraC・DNR混合物又は非リポソーム型AraC製剤を投与したP388細胞株移植モデルマウスの生存率

＜試験方法＞

P388細胞株（マウスリンパ球性白血病細胞株）を腹腔内に移植した雌性BDF-1マウスに対し、生理食塩液（対照）又はNS-87（6.25：2.5mg/kg、12.5：5mg/kg）、非リポソーム型AraC・DNR混合物（12.5：5mg/kg、18.5：7.5mg/kg）、非リポソーム型AraC製剤（1,000mg/kg）を移植後1、4、7日目に静脈内投与した。移植後67日目まで観察し、生存数、MST、%ILSを算出し比較した。

2）WEHI-3B細胞株移植モデルマウスにおける生存延長作用（マウス）

WEHI-3B細胞株を腹腔内に移植したマウスを用いて、NS-87と非リポソーム型AraC・DNR混合物との薬効を比較した。
NS-87投与群は非リポソーム型AraC・DNR混合物と比較して生存延長作用を示し、12：5.3mg/kg投与群のMSTは82日以上、%ILSは413%以上、移植後82日目の生存数は6例中6例であった。NS-87と等用量の非リポソーム型AraC・DNR混合物12：5.3mg/kg投与群のMSTは30.5日、%ILSは91%で、移植後82日目まで生存した個体はいなかった。非リポソーム型AraC・DNR混合物25：11mg/kg投与群のMSTは35.5日、%ILSは122%であり、600：9mg/kg投与群のMSTは49.5日、%ILSは209%であったが、NS-87投与群と比較し顕著な体重減少を含む毒性所見が認められた。

NS-87及び非リポソーム型AraC・DNR混合物を投与したWEHI-3B細胞株移植モデルマウスにおける生存率

＜試験方法＞

WEHI-3B細胞株（マウス骨髄単球性白血病細胞株）を腹腔内に移植した雌性CD-1ヌードマウスに対し、生理食塩液（対照）又はNS-87（6：2.64mg/kg、10：4.4mg/kg、12：5.3mg/kg）、非リポソーム型AraC・DNR混合物（12：5.3mg/kg、25：11mg/kg、300：4.5mg/kg、600：9mg/kg）を移植後1、4、7日目に静脈内投与した。移植後82日目まで観察し、生存数、MST、%ILSを算出し比較した。

（2）NS-87とAraC又はDNRの単剤リポソームとの比較

1）P388細胞株移植モデルマウスにおける生存延長作用（薬剤投与：移植後4、7、10日目）（マウス）

本試験は薬効をより厳正に評価するため、P388細胞株移植モデルマウスを用いた他の試験と比べて、薬剤投与開始時期を3日間ずつ遅らせ、移植後4、7、10日目に静脈内投与してNS-87とAraC又はDNRの単剤リポソームとの薬効を比較した。
NS-87投与群はAraC又はDNRの単剤リポソームと比較して生存延長作用を示し、12：5.3mg/kg投与群のMSTは64日以上、%ILSは814%以上、移植後64日目の生存数は6例中5例であった。
AraCの単剤リポソームの最大投与量15mg/kg投与群のMSTは19.5日、%ILSは179%、DNRの単剤リポソームの最大投与量10mg/kg投与群のMSTは29.5日、%ILSは321%であり、64日目まで生存した個体はいなかった。

NS-87及びAraC又はDNRの単剤リポソームを投与したP388細胞株移植モデルマウスにおける生存率

＜試験方法＞

P388細胞株（マウスリンパ球性白血病細胞株）を腹腔内に移植した雌性BDF-1マウスに対し、生理食塩液（対照）又はNS-87（6：2.64mg/kg、10：4.4mg/kg、12：5.3mg/kg）、AraCの単剤リポソーム（10、15mg/kg）、DNRの単剤リポソーム（4.4、10mg/kg）を移植後4、7、10日目に静脈内投与した。移植後64日目まで観察し、生存数、MST、%ILSを算出し比較した。

2）WEHI-3B細胞株移植モデルマウスにおける生存延長作用（マウス）

WEHI-3B細胞株移植モデルマウスを用いて、NS-87とAraC又はDNRの単剤リポソームとの薬効を比較した。
NS-87投与群はAraC又はDNRの単剤リポソームと比較して生存延長作用を示し、12：5.3mg/kg投与群のMSTは102日以上、%ILSは343%以上、移植後102日目の生存数は6例中5例であった。
NS-87の12：5.3mg/kg投与群と等用量のAraCの単剤リポソーム12mg/kg投与群及びDNRの単剤リポソーム5.3mg/kg投与群のMSTはそれぞれ26.0日、38.5日、%ILSはそれぞれ13.0%、67.0%であり、移植後102日目までにおける生存数は、それぞれ6例中0例、6例中2例であった。

NS-87及びAraC又はDNRの単剤リポソームを投与したWEHI-3B細胞株移植モデルマウスにおける生存率

＜試験方法＞

WEHI-3B細胞株（マウス骨髄単球性白血病細胞株）を腹腔内に移植した雌性CD-1ヌードマウスに対し、生理食塩液（対照）又はNS-87（6：2.64mg/kg、10：4.4mg/kg、12：5.3mg/kg）、AraCの単剤リポソーム（12、20mg/kg）、DNRの単剤リポソーム（5.3、12mg/kg）を移植後1、4、7日目に静脈内投与した。移植後102日目まで観察し、生存数、MST、%ILSを算出し比較した。

3. 骨髄内分布

（1）CCRF-CEM細胞株移植マウスにおけるNS-87の骨髄への蓄積（マウス）

CCRF-CEM細胞株（ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株）を移植したモデルマウスにおいて、ほぼ全ての測定時点で、NS-87投与群は非リポソーム型AraC・DNR混合物投与群に比べて骨髄中AraC濃度及びDNR濃度が上回っており、骨髄中のAraCとDNRのモル比は24時間後まで5：1～2：1付近を維持した。

＜試験方法＞

CCRF-CEM細胞株（ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株）を尾静脈内に移植した雌性Rag2-Mマウスに対し、移植3週間後にNS-87（10：4.4mg/kg）、非リポソーム型AraC・DNR混合物（300：4.5mg/kg）を3日ごとに3回静脈内投与した。薬物投与2、4、8、24時間後にマウス大腿骨から骨髄を採取し、骨髄中AraC濃度及びDNR濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した。また、AraC：DNRのモル比は大腿骨における薬物濃度から算出した。

（2）CCRF-CEM細胞株移植マウスの骨髄におけるNS-87の白血病細胞への取り込み（マウス）

CCRF-CEM細胞株（ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株）を移植したモデルマウスにおいて、CCRF-CEM細胞10⁶cellsあたりの取り込み量はAraCで24pmol、DNRで16pmol、正常骨髄細胞10⁶cellsあたりの取り込み量はAraCで2.6pmol、DNRで7.0pmolであり、CCRF-CEM細胞株ではマウス正常骨髄細胞に比べてAraCが9倍以上、DNRが2倍以上含有されていた。
また、10⁶cellsあたりのリポソーム脂質の取り込み量は、CCRF-CEM細胞で219pmol、正常骨髄細胞で117pmolであり、CCRF-CEM細胞株は正常骨髄細胞に比べて約2倍のリポソーム脂質を取り込んでいた。

試験成績^a
	NS-87の取り込み量（pmol/10⁶cells）
	AraC	DNR	リポソーム脂質
正常骨髄細胞	2.6±0.9	7.0±3.0	117±4.3
CCRF-CEM細胞株	24±4.2	16±3.2	219±11
取り込み比^b	9.5	2.2	1.9

a：各値は平均値±標準偏差（n=3）
b：CCRF-CEM細胞株における取り込み量/正常骨髄細胞における取り込み量

＜試験方法＞

CCRF-CEM細胞株（ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株）を尾静脈内に移植した雌性Rag2-Mマウスに対し、移植4週間後に二重放射標識［［³H］AraC及び［¹⁴C］DPPC（リポソーム脂質：ジパルミトイルホスファリジルコリン）］したNS-87（10：4.4mg/kg）を単回静脈内投与した。薬物投与18時間後にマウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、CCRF-CEM細胞株とマウス正常骨髄細胞に分離した。各細胞画分において、放射標識されたAraC濃度とリポソーム脂質濃度をシンチレーションカウンターで測定し、DNR濃度を高速液体クロマトグラフィーで測定した。

（3）NS-87の白血病細胞への取り込み機構（in vitro）

リポソーム脂質膜（DPPC）を標識したNS-87を用いてCCRF-CEM細胞株（ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株）及びK562細胞株（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）への取り込みを検討した。

① CCRF-CEM細胞株及びK562細胞株のいずれにおいても、DNRは添加後30分には核への移行が認められ、24時間まで継続した。リポソームの挙動を示すインドカルボシアニン色素（DiD）の青色蛍光は、NS-87添加後30分では細胞膜、核周辺、細胞質に点状に確認されたが（図1-A及びG）、24時間後には減少した（図1-B及びH）。

② 4℃の条件でNS-87又は非リポソーム型DNRをCCRF-CEM細胞株に添加したところ、非リポソーム型DNRはCCRF-CEM細胞株に取り込まれたが、NS-87に封入されているDNRは細胞に取り込まれなかった。

図1：CCRF-CEM細胞株及びK562細胞株へのDiD標識NS-87の取り込み

＜試験方法＞

① CCRF-CEM細胞株（図1-A及びB）及びK562細胞株（図1-G及びH）にDiDでリポソーム脂質膜を標識したNS-87を添加し、30分後及び24時間後に蛍光共焦点顕微鏡でDiDの青色蛍光及びDNRの赤色自己蛍光を観察した。

② CCRF-CEM細胞株に100μMのDNRを含むNS-87（図2-A及びB）又は100μMの非リポソーム型DNR（図2-C及びD）を添加し、4℃で1時間インキュベーションした後、微分干渉顕微鏡にて細胞の形態を、蛍光共焦点顕微鏡にてDNRの赤色自己蛍光を観察した。